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中药指纹图谱的分析、技术

归档日期:06-24       文本归类:指纹分析      文章编辑:爱尚语录

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  随着分离分析技术的发展,中药质量研究也由过去“四大鉴别”(基元鉴别、性状鉴别、显微鉴别、理化鉴别)发展到反映中药材全貌的指纹体系,即反映中药材的多元化学组成特性的化学指纹图谱和反映生物体 (除矿物、树脂类外) 特性的基因指纹图谱,从有效成分和遗传物质两方面实现对中药材的质量控制,为中药材以及中成药提供综合的和可量化的质量评价方法。 中国中药指纹图谱的研究已有相当的基础,最早可以追溯到20世纪60年代,如采用薄层色谱、紫外光谱、红外光谱法来描述中药材主要成分的特征,这是早期的原始的指纹图谱,具有直观、在简单情况下容易比较差异的优点。随着分析技术的飞速发展和微电脑的广泛应用,基于化学计量法的中药指纹图谱的研究方法向高效、灵敏、专属、智能化、联用型的方向发展,高效液相、高效毛细管电泳、高速逆流色谱、核磁共振、近红外光谱等新兴分析技术的应用和各种数学分析方法的运用,为中药指纹图谱的研究与发展提供了广阔的前景。

  紫外光谱法是1995年以前指纹图谱常用的方法。由于不同中药所含的不饱和程度有差异,因而导致其紫外吸收曲线的形态、峰位、峰强度亦有差异,以此达到鉴别效果。常用导数光谱及结合各种数学分析法来消除样品中的一些无关吸收,排除原图谱中的某些干扰。

  红外光谱又称分子振动转动光谱,是一种分子吸收光谱。当样品受到频率连续变化的红外光照射时,分子吸收了某些频率的辐射,并由其振动或转动运动引起偶极矩的净变化,产生分子振动和转动能级从基态到激发态的跃迁,使相应于这些吸收区域的透射光强度减弱。记录红外光的百分透射与波数或波长关系的曲线,就得到红外光谱。一般的红外光谱是对整个化合物分子的鉴别,比单纯的官能团的化学定性鉴别专一性更强。而中药材的红外光谱在本质上与纯化合物红外光谱不同,它是混合物中各个组分红外光谱的叠加。中药材各种化学成分只要在质和量的方面相对稳定,并且样品处理方法按同一要求进行,则其红外光谱也是应该相对稳定的。因此这样得到的混合物红外光谱应该是具有一定的客观性和可重复性。利用上述原理,不同混合物的红外光谱各主要吸收峰归属,只要在4000-400cm,范围内比较光谱差异即可。这种差异可以表现在三个方面:一是在某一波数处鉴别双方只有一方有明显差异;二是在某一波数内,鉴别双方的光谱中,吸收峰的形状和强度都有明显差异;三是“指纹区”,面貌不同。

  近红外光谱法(NIRS)是一种用于鉴定有机物质十分有用的技术,是中红外光谱中C-H, N-H,O-H和S-H的共振吸收,具有高信息量。波长范围为780nm-2500nm,而且该光谱取决于粒子大小、多晶型、残留溶剂、湿度等等因素。因此待测物光谱的鉴定不可能直接与参比物质光谱比较后确定,需要通过一系列样本的检测(必须预先知道样本中相关成分的含量或样本的定性归属),运用化学计算学手段,建立样本与信息之间的数学模型。运用该模型即可以对未知样本(例如新近购进的原药材或新生产的成品等)进行辨别分析(给出结果:合格与否、含量多少等)。该方法为非破坏性方法,可实现产品的无损检测,具有检测速度快,操作简单,所需样品少,适宜于液体、固体、粘稠流体的分析及过程控制等优点。但是在进行定性定量分析中必须采用一定的数据处理,需要掌握一定的化学计量知识。

  中药注射剂常含荧光性物质,但因不同注射剂所含具体荧光性物质不同,同种注射剂又因厂家的具体配方的差异或制备工艺条件的波动,均会使其特征的荧光激发、发射光谱不同或其强度呈现差异;根据注射剂的荧光图谱的差异达到快速鉴别、认定和控制配方、工艺的目的。

  荧光光谱不像红外光谱那样具有明显的指纹特征,但具有高灵敏度的显著优势,且差异更为一目了然,易于判断,因此,可以作为红外光谱指纹技术的一种补充,用于中药注射液的鉴别和认定,以及生产工艺的控制和成药热稳定性研究等。 色谱指纹图谱最实用、应用也是最广泛。中药色谱指纹图谱是一种综合的、可量化的鉴别手段,是当前符合中药特色的评价中药真实性、稳定性和一致性的质量控制模式之一。色谱指纹图谱最大的优点是具有分离的功能。

  TLC为传统的定性、半定量分析方法,在中国“七五”、十一五”及“九五”公关课题中有大量采用薄层色谱法进行地道药材的定性鉴别。该法操作简单、分析速度快速、一次分析样品多,提供信息量大,用固定波长对薄层展开的各个斑点进行扫描,所得扫描图谱比目测的层析图谱更加客观准确,因此具有较好的指纹鉴别意义。其最大的缺点是重现性以及精密度差,所以在指纹图谱应用中受到限制,但可以作为中药指纹图谱研究的借鉴和补充。

  GC最适合于各种主含易挥发性成分药材及其制剂的分析,尤其是毛细管气相色谱法,分辨率很高,往往一个色谱可以分出百个成分。该法灵敏度高、分离度好,分析速度快,但是分析范围只是局限于低沸点成分,是指纹图谱研究的主要方法之一。

  HPLC适用于成分复杂而不易分离的分析对象,具有分离效能高,灵敏度高,分析速度快,不需要气化,检测手段多等优点,是目前指纹图谱技术中用途最广泛的一种方法。

  HSCCC是当前国际流行的新型的液-液分配技术。应用动态液一液分配原理,利用相对移动互不混溶的两相溶剂,在处于动态平衡的两相中将具有不同分配比的样品组分离。其特点是不用固相载体作固定相,克服了样品吸附、损失、峰形拖尾问题。操作更为简便,容易掌握。对样品的预处理要求低,仅需一般粗提物即可。该技术的回收率高,能实现梯度操作,亦能重复进样,在中药质量分析控制研究中,尤其在指纹图谱研究中有较好的应用前景。

  毛细管电泳(CE)又叫高效毛细管电泳(HPCE),以弹性石英毛细管为分离通道,以高压直流电场为驱动力,依据样品中各组分之间淌度和分配行为的差异而实现分离的电泳分离分析方法,是近年发展起来的一种新的分离技术,是电泳技术和层析技术结合的产物,兼有高压电泳的高速高分辨率及HPLC的高效率等特点,其选择性与高效液相有很大的互补性。因此在指纹图谱研究方面的应用越来越广泛。

  联用技术 由于中药复方制剂成分复杂,现行的各种单一测定方法给出信息少均无法建立较完善的指纹图谱,因而有人提出建立多维指纹谱尝试解决这一问题。所谓多维,即采用多种分析仪器联用的模式来测定指纹图谱,各谱图间相互补充信息,可对复杂供识品有更清晰完整的认识。目前最常用的是高效液相(或气相色谱)/二极管阵列检测器/质谱/质谱联用方式 (HPLC或GC/ DAD/ MS/ MS) 所得的多维指纹图谱。多维谱的建立既能较系统、较完整地解决中药复方制剂质量控制的难题,又为中药研究中缺乏标准品的难题提供了种新的解决途径。除了手性化合物外,从概率上要找出4个或以上图谱信息完全相同的化合物几乎是不可能的。 随着分子生物学技术的迅速发展,DNA分子技术己越来越多的用于中药材品种鉴别的研究。分子生物指纹图谱是指采用分子标记技术得到的某一中药材品种的DNA指纹图谱。如对于人参、西洋参一类中药材的鉴别,用传统的方法(性状、显微、理化等鉴别方法)都显片面性,结果往往很模糊,因而其产地、生长年限、加工方式等因素与其性状和成分不呈很强的相关性,但应用分子生物学技术可以迎韧而解。

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